Респираторная медицина. Руководство (в 2-х томах) - Чучалин А. Г. - Страница 10

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННЫХ ДЕФЕКТОВ.

Точным, хотя и дорогостоящим, методом для характеристики генов заболевания у индивидуальных пациентов можно считать клонирование этих генов и полное секвенирование. Грубую информацию о структурных генных повреждениях получают посредством так называемого рестрикционного анализа. При этом геномную ДНК пациентов разрезают с помощью специфических энзимов (рестрикционных эндонуклеаз), разделяют при помощи электрофореза и гибридизируют с помощью специфического генного зонда [48]. Из полученного таким образом рестрикционного образца распознаются большие генные дефекты, а часто даже патогенные точечные мутации. Современная технология, которую можно использовать для быстрого доказательства таких мутаций, и есть так называемая полимеразная цепная реакция - ПЦР [14]. Технология ПЦР используется для диагностики моногенных, а также инфекционных и злокачественных заболеваний. Ее принцип - размножение (амплификация) in vitro сегмента ДНК, имеющегося в мизерном количестве. Это автоматизированный процесс с использованием последовательно специфического праймера - олигонуклеотида и термоустойчивой синтезированной ДНКполимеразы для энзиматического увеличения количества ДНК на выходе. На практике из нескольких микролитров крови пациента выделяют геномную лейкоцитарную ДНК, которая содержит мизерные количества необходимой для исследования целевой последовательности. Для структурного анализа (например, секвенирования) эти количества были бы слишком незначительны, однако с помощью ПЦР они амплифицируются более чем в 106 раз. Помимо геномной ДНК, могут амплифицироваться и секвенироваться индивидуальные рибонуклеиновые кислоты (РНК). Для этого сначала выделяют клеточную общую РНК, которая используется для синтеза in vitro комплементарной ДНК (сДНК), а затем амплифицируется как обычная ДНК с помощью ПЦР.

В последнее время появились методы, позволяющие прямо секвенировать ПЦРпродукты из геномной ДНК без предшествующего клонирования [44]. Эта технология освобождает от необходимости клонирования индивидуального гена и имеет большое значение для характеристики генных дефектов. В распоряжении исследователя для реализации этой технологии имеются специальные радиоактивные и автоматизированные протоколы.

Генное сканирование.

Хотя ПЦРамплификация и прямое секвенирование - очень эффективные и быстрые методы для характеристики генных дефектов человека, все-таки пока есть определенные проблемы. Одна из них - обследование (сканирование) гена в целом на наличие точечных мутаций. Эта проблема возникает, например, при анализе кандидатных генов и подозрении, что они несут при определенном заболевании патогенные мутации, распределенные на протяжении всего гена. В качестве предварительного этапа секвенирования при такой проблеме разработали так называемую технику генного сканирования, которая позволяет ответить на вопрос, имеются ли вообще какие-либо мутации в обследуемой области. Тогда при наличии этой предварительной информации, а затем при окончательной характеристике посредством секвенирования возможно ограничение на действительно нужной (позитивной) области обследования. Все техники сканирования базируются на ПЦРтехнологии и при относительно небольшой трудоемкости позволяют обследовать гены на наличие мутаций у большого числа пробандов.

ТРАНСФЕР ГЕНОВ IN VIVO .

Существуют следующие принципы генной терапии:

---дефектный ген, являющийся причиной моногенного наследственного заболевания, замещается на функционально способный ген (генная аугментация). Примером такой генной терапии может служить тяжелый комбинированный иммунодефицит, когда производится трансфер гена аденозиндезаминазы;

---трансферируется ген, дополнительная экспрессия которого у пациентов при заболевании, не обязательно обусловленном дефектом гена, требует терапевтического воздействия. Примером этого может служить локальная экспрессия цитотоксической субстанции при малигноме;

---дефектный ген замещается функционально способным (здоровым) геном (генная коррекция посредством гомологичной рекомбинации) [11].

В первых клинических исследованиях по генной терапии генный трансфер производился ex vivo. Так, у пациента забирали целевые клетки генной терапии, например гепатоциты, клетки костного мозга или лимфоциты, изменяли их генно-техническим способом вне организма, а затем вводили вновь. В последнее время разработаны такие векторы трансферирующих генов, которые позволяют проводить у людей прямой трансфер генов in vivo. Например, аденовирусные векторы применяют при генной терапии для введения нормального муковисцидозного CFTRгена в эпителий дыхательных путей пациентов, страдающих МВ [10]. Сейчас интенсивно работают над развитием таких векторов, которые позволяют проводить органоспецифический in vivo трансфер в печень, костный мозг, эндотелий сосудов. Разрабатываются и другие способы соматической терапии коррекции гена.

ГЕННОЕ ПРИЦЕЛИВАНИЕ

(Gene Targeting). Для изучения сложных генетических патомеханизмов важно производство трансгенных животных посредством целевого изменения их генома. Животным создают генетические дефекты и анализируют их биологическое влияние на организм в целом. Речь идет о функции таких мутированных генов, воздействие на организм которых неизвестно или известно лишь частично. У трансгенных животных определенные гены могут полностью инактивироваться (Gene Disruption) или целевым образом мутагенизироваться (Targeted Mutagenesis). Была создана модель человеческого МВ на мыши, для чего мутагенизировали мышиный гомолог гена человеческого МВ [7]. Близким способом была создана на мыши модель альфа₁антитрипсинового дефицита человека. Создают и других трансгенных животных, например для изучения энзима супероксиддисмутазы.

type: dkli00012

ИЗВЕСТНЫЕ ГЕНЫ РИСКА РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ГЕН альфа1-АНТИТРИПСИНА

В начале 1960х годов из человеческой сыворотки был выделен трансингибиторный протеин, названный альфа₁антитрипсином, или ААТ. ААТ - это гликопротеин острой фазы, он подавляет как трипсин, так и целый ряд серинпротеиназ, а его главная физиологическая роль заключается в ингибировании протеолитического энзима - нейтрофильной эластазы [32]. Дальнейшее изучение ААТ выявило связь между его дефицитом и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Далее были изучены структура, функции и клиническое значение этого протеиназного ингибитора (PI) и показано его аутосомно-рецессивное наследование. Дальнейшее наблюдение за пациентами с ХОБЛ, ассоциированных с ААТ, выявило, что курение значительно ухудшало их состояние и укорачивало жизнь почти на 20 лет [25]. Развитие способов изучения протеина позволило обнаружить новое число выриантов этого протеина, например дефектную аллель Z. Было показано, что некоторые ААТдефектные аллели связаны не только с ХОБЛ, но и с заболеваниями печени: например, гомозиготный носитель Zаллели был связан с циррозом печени у маленьких детей, тяжелой гепатопатии - с дефектом аллели Mmalton и Mduarte [9].

Дальнейший поиск причины связи между заболеваниями легких и недостатком ААТ привел к развитию так называемой протеиназно-антипротеиназной теории . В огромном числе исследований было показано, что различные протеолитические энзимы нарушают матричную структуру легкого, что ведет к неадекватной работе легких. ААТ - доминирующий протеиназный ингибитор в бронхоальвеолярном смыве. С недавних пор в распоряжении врачей имеются препараты ААТ, которые реконструируют в легком эластазноингибиторный потенциал сыворотки у больных с дефицитом ААТ. Его применяют внутривенно или в виде аэрозоля [22].

Развитие современных технологий открыло новые возможности для анализа ААТассоциированных заболеваний. В 1980х годах ААТген был локализован, клонирован и секвенирован на хромосоме 14 [42]. Затем были клонированы и секвенированы многочисленные дефекты ААТгена, охарактеризованы возможные мутации и их влияние на синтез и функцию ААТ. Клонирование и структурный анализ ААТгена позволили провести генетический синтез гликозилированного человеческого ААТ в фибробластах. Появилась возможность прямого трансфера и локальной экспрессии ААТгена в дыхательных путях in vivo с помощью аденовирусного вектора. Генный продукт ААТ уже можно использовать для внутривенного и ингаляционного введения.