Болезни печени - Трофимов С. - Страница 10

Говорит о повреждении гепатоцитов возрастающий уровень активности трансаминаз — АлАТ и АсАТ, которые попадают в кровь из клеток печени сквозь поврежденные оболочки. Существуют также специальные тесты на состояние системы свертывания крови, в которой участвуют белки, синтезируемые в печени. Диагностическое значение имеет положительная реакция мочи на уробилин.

Свидетельствующим о нарушении функции печени, является показателем — тимоловая проба. Изменение протромбинового индекса характеризует тяжесть течения вирусного гепатита, а повышение активности щелочной фосфатазы, общего билирубина свидетельствуют о нарушении секреторной функции печени. Реакция мочи на желчные пигменты в начале болезни бывает положительной значительно реже.

В диагностике немаловажное значение, как острых, так и хронических форм вирусных гепатитов отводится ультразвуковому обследованию органов брюшной полости. С помощью этого метода врачи могут определить такие изменения, которые не обнаруживаются при внешнем обследовании: увеличение печени, сужение печеночных вен, уплотнение и утолщение их стенок, признаки воспаления желчного пузыря и поджелудочной железы, расширение воротной и селезеночной вен, увеличение селезенки, увеличение лимфатических узлов. Важнейшим методом диагностики, в особенности хронических гепатитов, является биопсия печени.

Методы обнаружения антител и антигенов в крови и других жидкостях организма включает в себя серологическая диагностика. Для ранней диагностики вирусных гепатитов, в том числе безжелтушных, бессимптомных форм, в сыворотке крови определяют наличие вирусных белков (антигенов, которые еще называют маркерами вирусных гепатитов) или антител к ним с помощью иммупоферментного анализа (ИФА). Кроме того, ИФА по возможности дополняется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяющей определить наличие в сыворотке крови вирусных нуклеиновых кислот — ДНК вируса гепатита В, РНК вирусов других гепатитов, что особенно важно для начала своевременного лечения.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — является универсальным методом иммунологической диагностики, который широко используется на практике. Он предназначен для выявления вирусных белков (антигенов) или антител, которые вырабатываются иммунной системой в ответ на проникновение вирусов в организм человека. Эти белки являются своеобразными маркерами (метками) или признаками, наличие которых позволяет поставить точный диагноз, оценить характер заболевания, помочь лечащему врачу выбрать правильное лечение. Этот метод основан на известном взаимодействии «антиген-антитело».

Для определения антигенов различные коммерческие фирмы выпускают тест-системы, которые представляют собой 96-луночные полистироловые планшеты. На дно лунок заранее сорбируют («пришивают») антитела к тому или иному антигену возбудителя, например, к поверхностному антигену вируса гепатита В — HBs-антигену. На первом этапе в каждую лунку добавляют образец, например, сыворотку крови больного в разных разведениях, содержащую пока не определенный вирусный белок (антиген). Если этот белок (антиген) «узнал» свое антитело, то происходит их связывание. Это означает, что сыворотка больного содержит тот антиген, антитела к которому сорбированы на дне планшетки. Для того чтобы увидеть результаты этой реакции, существует следующая стадия, на которой к комплексу «антиген-антитело» добавляют соединение, которое связывается с антителом. Это соединение содержит фермент, например, пероксидазу хрена. При добавлении к нему субстрата происходит расщепление последнего с последующим окрашиванием раствора в желто-коричневый цвет.

На следующей стадии проводят тщательную промывку каждой лунки от непрореагированных компонентов. В тех лунках, где антиген, как в нашем случае, полностью связан с антителом, он уже не может взаимодействовать с добавляемым соединением. Поэтому оно удаляется из лунки при отмывании. По мере разведения сыворотки содержание в ней антител снижается, и они уже не в состоянии полностью связать антиген. В этих лунках соединение, содержащее фермент, связывается с антигеном и остается в лунке после промывания. На следующей стадии добавляют субстрат и смотрят результаты реакции, которые оценивают визуально или с помощью спектрофотометра.

Таким образом, мы выявили, что в образце сыворотки от больного содержится HBs-антиген. Можно также выяснить его количество или титр, определив то последнее разведение сыворотки, где появилось желтое окрашивание. Чем больше степень разведения, тем больше вируса содержится в крови больного.

Подобным образом можно определить наличие антител к тому или иному возбудителю вирусного гепатита. Только в этих случаях используют диагностические тест-системы с «пришитыми» на дно лунок не антителами, а известными антигенами. Достоинствами этого метода являются высокая чувствительность и специфичность, простота постановки реакции, возможность обследования одновременно большого количества пациентов. Среди недостатков метода можно отметить необходимость специального дорогостоящего оборудования и соответствующей квалификации персонала.

Метод полимеразной цепной реакции — это молекулярная клиническая диагностика. Она включает в себя определение белков (антигенов), а также нуклеиновых кислот (или их характерных участков) — возбудителей разных заболеваний. Она начала особенно интенсивно развиваться в начале 1970-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии (создание моноклональных антител и открытие в 1985 году метода ПЦР). Эти достижения существенным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику па принципиально иную высоту — уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биологической среде.

При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена одна искомая молекула нуклеиновой кислоты среди миллионов других. С точки зрения клинической медицины определение нуклеиновой кислоты равнозначно обнаружению возбудителя в объекте исследования.

Из биологии известно, что нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) обладают свойством к саморепродукции (воспроизводству). Этот принцип и лежит в основе метода ПЦР, когда этот процесс осуществляется искусственно в лабораторных условиях. Для этого из полученного от больного образца ткани (например, в случае подозрения на вирусный гепатит) выделяют сначала нуклеиновую кислоту. Она выполняет роль своеобразной «матрицы», на которой осуществляется синтез. Нуклеиновая кислота имеет свой «отпечаток» — уникальную последовательность нуклеотидов, из которых она состоит. Для каждого возбудителя такая последовательность изучена, составлена своеобразная «карта».

Самый главный элемент в ПЦР — это праймер (короткие участки ДНК, комплементарные (соответствующие) участкам выделенной из образца нуклеиновой кислоты). Праймеры обеспечивают запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси нуклеиновых кислот испытуемого образца, праймера и специальных ферментов (полимераз)) с помощью которых эта реакция невозможна. ПЦР-анализ включает несколько циклов (этапов), в результате которых получаются точные копии распознаваемого участка матричной нуклеиновой кислоты. Эти циклы повторяются 30–50 раз в соответствии с заданной программой. Конечный продукт этой реакции распознается с помощью метода электрофореза в геле.

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий ДНК или РНК в 1 мл раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту, даже если ее концентрация составляет несколько сот копий в 1 мл образца. С этим связано общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем — диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.