Геном человека. Энциклопедия, написанная четырьмя буквами - Тарантул Вячеслав Залманович - Страница 12

Сама процедура ПЦР заключается в следующем. Прежде всего, ДНК денатурируют, нагревая ее до 98°С. При этом две цепи ДНК, относительно слабо связанные между собой, разделяются друг от друга. Далее в ход идут так называемые затравки (праймеры) — короткие однонитевые фрагменты ДНК, которые комплементарны краям того участка генома, который собираются размножать (амплифицировать). Эти затравки гибридизуются с комплементарными участками однонитевых молекул ДНК, после чего специальный фермент (ДНК-полимераза) удлинняет затравки, строя молекулу ДНК по матрице (цикл 1). Затем продукты реакции вновь денатурируют и процедуру повторяют необходимое число раз. За 20–30 циклов из одной молекулы можно получить миллионы копий ДНК. Этот процесс подобен цепной ядерной реакции, но осуществляется в пробирке с помощью специального фермента — термостабильной ДНК-полимеразы. По этой причине он и получил название полимеразной цепной реакции.

Рис. 14. Схема протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Конечная цель — определение полной последовательности нуклеотидов в ДНК человека

Длительное время искали эффективные методы, позволяющие определять последовательность нуклеотидов в длинных молекулах ДНК (такое определение нуклеотидной последовательности получило название секвенирование, от анг. sequence — последовательность). Только в середине 70-х годов секвенирование протяженных участков ДНК стало возможным. Связано это было с изобретением принципиально новых подходов. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод прямого секвенирования, основанный на химической деградации ДНК. В данном случае осуществляется специфическая химическая фрагментация длинной цепи ДНК (полинуклеотида), радиоактивно меченной с одного конца. Затем препарат меченой ДНК разделяют на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований, содержащихся в ней. После разделения в специальном геле меченых фрагментов по размерам (с помощью электрофореза) на рентгеновских пленках смотрят, что при этом происходит с нуклеотидной последовательностью, и на основании этого делают вывод о порядке расположения нуклеотидов друг за другом в каждом фрагменте ДНК. Однако метод оказался довольно сложным. В становлении этого метода на его начальных этапах существенную роль сыграл российский ученый академик А. Д. Мирзабеков, работавший в лаборатории У. Гилберта.

Чуть раньше английский ученый Фред Сэнгер предложил иной способ расшифровки структуры ДНК, который в конечном итоге после разных модификаций стал основным. Согласно методу Сэнгера молекулу ДНК с помощью специальной обработки ферментами не только расщепляют на фрагменты, но и «расплетают» ее двойную спираль на две нити. Потом по каждому из полученных обрывков «нитей» с помощью специальных затравок восстанавливают недостающую вторую нить ДНК. При этом синтез второй нити осуществляется не полностью, а с помощью специального приема обеспечивается прекращение синтеза строго на одном из 4 нуклеотидов. В результате этого получался набор цепей ДНК с разной длиной — «лесенка». Эта «лесенка» становится видимой глазом после разделения всех фрагментов по размерам за счет того, что концы всех фрагментов содержат специфическую — или радиоактивную, или флуоресцентную метку. Следует отметить, что в разработку этого поистине революционизирующего метода существенный вклад был сделан и двумя российскими учеными: профессором С. К. Василенко и академиком Е. Д. Свердловым.

За разработку методов секвенирования Гилберт и Сэнгер получили Нобелевскую премию. Интересно, что для Сэнгера эта была уже вторая премия, первую он получил за расшифровку аминокислотной последовательности первого белка — инсулина.

Все автоматы-секвенаторы, которые появились позднее, были построены по принципу метода Сэнгера, поскольку он оказался более удобным для автоматизации процесса и компьютерной регистрации результатов. В настоящее время ряд крупных фирм занимается производством таких автоматов, а также стандартных наборов реактивов для анализа ДНК. Секвенирование стало достаточно рутинной лаборантской работой. А метод Максама–Гилберта имеет сейчас скорее историческое, чем практическое значение.

Во всех случаях основное правило заключается в том, чтобы в препарате ДНК, который собираются секвенировать, все фрагменты имели, по крайней мере, один одинаковый конец, т. е. одну точку отсчета. В этот фиксированный конец вводят радиоактивную (или флуоресцентную) метку. После этого проводят дальнейшие специфические расщепления молекул с помощью ферментов или химических агентов по строго определенным азотистым основаниям. Условия расщепления при этом таковы, что на каждый меченый фрагмент в среднем приходится один разрыв. В результате после расщепления образуется набор фрагментов разной длины, каждый из которых начинается в точке отсчета, а заканчивается на или перед определенным типом нуклеотида.

Полученные фрагменты разделяют по размерам с помощью электорофореза в гелях. Маленькие фрагменты движутся быстрее более крупных, и в результате такой процедуры все фрагменты выстраиваются друг за другом в зависимости от своей длины. Результат такого разделения изображен схематически на рис. 15.

Рис. 15. Схема, поясняющая процесс подготовки и прочтения ДНКового текста

Так осуществляют секвенирование небольших фрагментов ДНК (не более 1000 нуклеотидов). Но геномы даже самых примитивных организмов имеют размер свыше 500 000 п. н. Как же их секвенируют? Для этого разработано несколько стратегий. Не будем вдаваться в подробности, но укажем на некоторые основные из них.

Секвенирование простых геномов

Для определения нуклеотидной последовательности (т. е. первичной структуры) конкретного района ДНК в первую очередь необходимо упростить ее, что достигается путем разрезания ее на относительно короткие фрагменты. Сделать это можно, например, с помощью специальных «скальпелей» для ДНК — ферментов рестриктаз, о которых уже шла речь выше.

При секвенировании простейших организмов, у которых геном относительно невелик, обычно используют процедуру, называемую условно «сверху вниз». Всю ДНК «разрезают» на кусочки с помощью уже упоминавшихся выше ферментов рестриктаз, затем секвенируют эти кусочки по отдельности, а после «склеивают» из них полный геном. «Склеивание» оригинала осуществляется за счет того, что нуклеотидные последовательности разных кусочков перекрываются друг с другом, т. е. одинаковы по концам. Эта методология получила название «дробовика». Суть данной процедуры отражена на рис. 16.

Рис. 16. Схема стратегии «дробовика», используемая для секвенирования больших молекул ДНК

Однако в случае такого очень сложного генома, как геном человека, начали с другого, а именно с определения положения известных генов и других генетических маркеров на отдельных хромосомах, то есть с генетического картирования генома. Подобную задачу генетическими экспериментами на более простых объектах пытался решить еще Т. Морган, который за свои работы получил Нобелевскую премию в 1933 году. Теперь появились более эффективные методы. Один из них, называемый методом «радиационных гибридов», заключается в следующем. Клетки человека, растущие вне организма в питательной среде, облучают рентгеном, что приводит к гибели клеток в результате разрыва хромосомной ДНК на куски, содержащие от 2,5 до 25 млн. п. н. Но прежде, чем убитые облучением клетки распадутся, их сливают с клетками хомяка, в результате чего в разные клетки хомячка попадают разные наборы фрагментов ДНК человека. Затем «гибридные» клетки размножают в культуре, при этом в них наряду с собственной ДНК реплицируются и фрагменты чужеродной ДНК. Затем определяют состав известных генов и других генетических маркеров в каждой клеточной линии и, статистически обработав полученные данные, выводят наиболее вероятное их взаимное расположение в хромосомах. В качестве генетических маркеров использовали как гены, так и фрагменты ДНК с неизвестной функцией. Для картирования хромосом важным свойством маркеров являлся их полиморфизм, т. е. существование разных форм среди индивидуумов.